Hij volgde zijn oom Justinus I 518-527 op voor wie hij al een deel van de regeringstaken op zich genomen had. Justinianus keerde terug naar een orthodoxe politiek, nam daarmee afstand van de pro-monofysitische politiek van Anastasius I en herstelde de relaties met Rome. Hij sloot ook de Academie van Athene in 529, die nog altijd het heidense neoplatonisme propageerde.

Justinianus kon steunen op een aantal uitstekende hoge ambtenaren en generaals, zoals Belisarius en later Narses (opperbevelhebbers), Johannes van Capadocië (financiën) en Tribonianus (justitie). De keizer zelf was zeker niet onbegaafd, maar hij wilde wel alles tegelijk en dat zou uiteindelijk veel van zijn werk weer ongedaan maken.

Justinianus hield van grootste bouwplannen, die veel geld kostten. Zijn meest bekende bouwwerk is de beroemde Hagia Sofia. Zijn regering is ook gekenmerkt door de evenzeer beroemde Codex Justinianus van 529, een ware mijlpaal in de geschiedenis van de wetgeving.

Er waren echter ook binnenlandse moeilijkheden. In 532 brak er een oproer uit, dat naar de strijdkreet van de oproerkraaiers Nika! (Overwinning) het Nika-oproer genoemd wordt. Justinianus had oorspronkelijk de Blauwen gesteund tegen de Groenen, maar probeerde nu van beide demen afstand te nemen. Het gevolg was dat het onmogelijke mogelijk bleek. Groen en Blauw rezen samen op in woede. Er werd zelfs een neef van Anastasius tot keizer uitgeroepen, maar keizerin Theodora wilde daar niets van weten. Uiteindelijk kostte het wel een bloedbad maar zij hield haar eega in het zadel. De uitkomst was een duidelijke overwinning voor de gecentraliseerde monarchie ten koste van de stem van het volk, zoals die zich in de demen-partijen geuit had.

Justinianus trachtte de kring van betrekkingen die Byzantium met de buitenwereld onderhield verder uit te breiden. De kontakten met China via de zijderoute werden bemoeilijkt door het Perzische Rijk, zodat hij met de Turken ten noorden van de Kaukasus een verdrag sloot. Byzantium had goede hoop met hen een duurzame relatie van wederzijds belang op te bouwen. Ook aan de zuidzijde probeerde Byzantiun om het Perzische Rijk te omzeilen naar India toe door met Axum in Ethiopië kontakten te leggen. De grip van de Perzen op de handel in de Indische Oceaan was echter te sterk, ook voor hun Ethiopische mededingers.

In 532 sloot Byzantium echter een 'eeuwige' vrede met Khusro I van Perzië. Dat stelde Byzantium in staat zich aan de herovering van het westen te gaan wijden. In tegenstelling tot wat er in 468 gebeurd was, was een expeditie tegen de Vandalen in Afrika nu wel een succes. In 533 werd koning Gelimer verslagen, hoewel het tot 548 duurde tot heel Noord-Afrika onder controle was.

Ook de Ostrogothen moesten er aan geloven. In 535 nam Belisarius Sicilië en Napels in terwijl een ander leger vanuit Dalmatië binnenviel. Ravenna werd ingenomen en in 540 werd koning Vitiges naar de hoofdstad aan de Bosporus weggevoerd. De Ostrogothen gaven echter niet op en er volgde een oorlog van twintig jaar, voor in 555 Italië eindelijk weer Romeins was. Het was inmiddels ook een rokende puinhoop. Er is wel gesteld dat deze Grieks-Gothische oorlog het echte einde van de Oudheid in deze streken was. Rome stond er zelfs enige tijd als lege spookstad bij en de lokale belastingen brachten dus niet zo veel op.

Ook in Spanje kreeg in 554 Byzantium weer voet aan de grond, ten koste van de Visigothen, zodat de Middellandse Zee weer echt een Mare Internum begon te worden, maar meer dan een bruggenhoofd was het niet en de Visigothen boden verbitterd tegenstand.

Inmiddels was de 'eeuwige' vrede met Perzië al weer voorbij, omdat Khosro in 540 Syrië binnenviel en Antiochië vernietigde. Hij deed hetzelfde met Armenië, Iberië en Lazica en nam dat laatste gebied aan de Zwarte Zee in bezit. Byzantium kon zich hier niet goed tegen weren, omdat het al op drie fronten zwaar in gevechten gewikkeld was.

Ook op de Balkan begon de toestand er dreigend uit te zien. Een nieuwe groep barbaren begon aan een lange reeks invallen: de Slaven. Dit vijfde front was weliswaar goed versterkt met een reeks forten, maar zonder mankracht viel er niets te verdedigen. De Slaven stroomden over de hele Balkan tot Korinthe en de Egeïsche Zee toe. Byzantium had duidelijk te veel hooi op de vork genomen en zag de bodem van de schatkist snel in zicht komen.

In 562 werd er tenmiste weer vrede met de Perzen gesloten, dit maal voor een halve eeuw, en Byzantium kreeg Lazica terug, zij het ten koste van nog meer schatting. In 568 ging echter een groot deel van de veroveringen in Italië weer verloren, dit maal aan de Langobarden die heel wat barbaarser waren dan de Gothen. Het Exarchaat van Ravenna hield nog wel een aantal gebieden onder controle, maar het hele schiereiland zou het nooit meer terugkrijgen. Ook Cordova, de basis in Spanje, ging eerst in 572 en uiteindelijk voorgoed in 584 weer in Visigothische handen over. De rest zou veertig jaar later volgen.